Sie sind hier: Skip Navigation LinksInstitut für Pathologie

Methodenverzeichnis

Die Molekularpathologie dient der Analyse von genetischen Veränderungen und wird für die Diagnose von bösartigen Tumorerkrankungen sowie Krankheitserregern eingesetzt. In der Tumordiagnostik können unter Verwendung spezieller molekularbiologischer Techniken die Prognose und mögliche personalisierte Therapiemöglichkeiten eingeschätzt werden.

Für die Untersuchungen werden Proben in Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Material (FFPE) verwendet. Zusätzlich kann für spezielle Fragestellungen auch die Einsendung von unfixiertem Material sinnvoll sein.​

Methoden basierend auf der Polymerasekettenreaktion (PCR)

Bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) wird eine bestimmte Gensequenz mehrfach vervielfältigt, um für die anschließende Diagnostik ausreichend Untersuchungsmaterial zu haben. Hierzu werden gezielt jene Gensequenzen amplifiziert, welche mutmaßli​ch für den Tumor oder die Erreger spezifisch sind. Das PCR-Produkt wird anschließend mit speziell für die Diagnosestellung ausgewählten Methoden analysiert.​

Endpunkt PCR

Die konventionelle oder Endpunkt-PCR amplifiziert die gewünschte Zielsequenz billionenfach in einem logarithmischen Anstieg. Möglich ist dies durch die Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase und spezifischen Oligonukleotiden (sog. Primern), die an bekannten Ziel​sequenzen binden und damit den Start- und Endpunkt des zu amplifizierenden Genbereiches markieren. Diese Methode wird beispielsweise beim Nachweis von Erregern verwendet.​

Quantitative PCR

Die quantitative PCR wird für die gleichzeitige Vervielfältigung und Detektion von PCR-Produkten eingesetzt. Der Vorteil hierbei ist, dass die PCR-Produkte während der Messung genau quantifiziert werden können. Möglich ist dies durch Fluoreszenz-markierte Sonden, die während der PCR an dem Amplifikaten binden und Lichtsignale abgeben, welche gemessen werden können. Durch den Vergleich mit Eichproben kann so der prozentuale Anteil an Tumorzellen bestimmt werden.​

Nested-PCR​​

Diese Methode wird oft für Erreger-Diagnosen verwendet und besteht aus zwei Teilschritten. In der ersten PCR werden durch eine geringere Anzahl an Zyklen nicht nur spezifische, sondern auch unspezifische PCR-Produkte gebildet. In der zweiten PCR werden neue, spezifische Primer verwendet, die einen Teil des gewünschten Fragmentes amplifizieren und so die Spezifität maßgeblich steigern​.

Hochauflösende Kapillargelelektrophorese

Die Fragment-Längenbestimmung von PCR-Produkten kann mittels Kapillargelelektrophorese durchgeführt werden. Hierbei nutzt man  die negative Ladung von den DNA-Fragmenten aus, da diese in einem quervernetzten Agarosegel zur positiv geladenen Anode wandern. Auf diese Weise können die PCR-Produkte visualisiert und mit bekannten Fragmentlängenmustern bestimmter Erkrankungen wie T-und B-Zell-Neoplasien  oder Mikrosatelliteninstabilitäten verglichen werden.

Sequenzanalyse nach Sanger

Die nach ihrem Entwickler benannte Sanger-Sequenzierung nutzt für die Sequenzanalyse von DNA-Fragmenten neben Nukleotiden auch Fluoreszenz-markierte Didesoxynukleotide. Der Einbau dieser markierten Nukleotide führt zum Abbruch der Reaktion, sodass Fragmente unterschiedlicher Längen entstehen. Da jedes der vier Didesoxynukleotide einen spezifischen Fluoreszenzfarbstoff tragen, lässt sich durch Analyse in einem Polyamidgel die genaue Reihenfolge der Sequenz ablesen.

Die genaue Darstellung der genetischen Veränderungen ist bei dieser Methode möglich, allerdings wird wegen der geringen Sensitivität ein minimaler Tumorzellgehalt von 20% benötigt.​

Pyrosequenzierung

Für die Untersuchung der Mutationslast in Tumorproben kann die Pyrosequenzierung als Untersuchungsmethode dienen. Während der DNA-Synthese werden nacheinander die vier Fluoreszenz-markierten Nukleotide zum Einbau durch die DNA-Polymerase angeboten und wieder ausgewaschen. Bei erfolgreichem Einbau eines der Nukleotide wird ein Lichtsignal abgegeben und über die Stärke dieses Signals lässt sich eine Aussage über die eingebaute Anzahl des jeweiligen Nukleotids schließen. Der Nachteil dieser Methode liegt darin, dass sich unbekannte oder sehr komplexe Mutationen nicht ermitteln lassen.​

Next Generation Sequenzierung (NGS)

Durch die Etablierung der Next Generation Sequenzierung steht nun ein Hochdurchsatzverfahren zur Verfügung, das es ermöglicht gezielte Stufendiagnostik und multiple Genuntersuchungen durchführen zu können.

Für die Analyse wird das Genmaterial aus FFPE-Proben nach der DNA-Isolierung enzymatisch fragmentiert, gezielte Sequenzbereiche PCR-basiert amplifiziert und anschließend durch DNA-Adaptoren an eine Flusszelle gebunden. Die parallele Sequenzierung tausender Genfragmente erfolgt durch den Einbau von Fluoreszenz-markierten Nukleotiden. Da jedes der vier Nukleotide ein spezifisches Fluoreszenzmolekül trägt, lässt sich anhand der Abfolge der Signale während der Gensynthese die Sequenz bestimmen. Die eingebauten Nukleotide tragen eine Terminatorgruppe, welche nach Auslesen des Signals abgespalten wird, sodass das nächste Nukleotid eingebaut werden kann.

Die Auswertung der Sequenzierdaten erfordert einen hohen Durchsatz von bioinformatischen Berechnungen und erzielt optimalerweise eine Überlappung der Sequenzen. Durch den Abgleich mit externen Datenbanken können nun die zugrunde liegenden Mutationen sowie die Höhe der Mutationslast aus den Daten abgelesen werden.​

Vision Array Chip (Zytomed)

Für die Detektion und Klassifizierung von HPV-Viren und Mycobakterien steht ein Array-System der Firma Zytomed zur Verfügung. Nach der DNA-Isolierung werden Erreger-spezifische Genbereiche mittels PCR amplifiziert und anschließend auf einem Array an DNA-Sonden gebunden. Anschließend wird ein Detektionssystem an den PCR-Fragmenten gebunden und die Visualisierung der Erreger ist über eine kolorimetrische Reaktion möglich.

Der Array verfügt neben Positivkontrollen auch über die Möglichkeit die Erreger zu typisieren. So können 41 HPV-Typen bzw. 16 Mycobakterien-Spezies unterschieden werden.​

Chromogene in situ Hybridisierung (CISH)

Die direkt am histologischen Schnittpräparat durchgeführte In situ Hybrisierung kommt ohne Genamplifizierung aus. Für die Untersuchung werden mit Permanentfarbstoff-markierte DNA-Sonden verwendet, um die gewünschten Genbereiche optisch sichtbar zu machen. Eine Diskriminierung von Gen-Translokationen und Genamplifizierungen werden dadurch möglich.​

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