Archiv September 2012

Können evolutionäre Daten Hinweise auf den Einfluss von Mutationen in G-Protein-gekoppelten Rezeptoren liefern?  

Für mehrzellige Organismen ist die Kommunikation zwischen Zellen von großer Bedeutung. Rezeptoren spielen bei der Weiterleitung extrazellulärer Signale in das Zellinnere eine entscheidende Rolle. Die Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) stellt dabei die größte Gruppe der Transmembranrezeptoren in Vertebraten dar. GPCR erkennen eine Vielzahl chemisch unterschiedlicher, extrazellulärer Botenstoffe wie Adrenalin, Dopamin und Azetylcholin. Eine Vielzahl von therapeutischen Wirkstoffen wie Beta-Blocker, Morphin und Antidepressiva greifen an diesen Rezeptoren an. Die Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von GPCR ist von großer Bedeutung, um die Funktionsweise dieser physiologisch und therapeutisch sehr wichtigen Rezeptoren zu verstehen. Dabei sind Informationen über die funktionelle Relevanz jeder einzelnen Aminosäureposition unabdingbar. In manchen Fällen ist dies allerdings nicht möglich, da geeignete funktionelle Untersuchungsmethoden fehlen.
In dieser Arbeit wurde erstmals untersucht, ob Sequenzdaten von Orthologen (gleiches Protein unterschiedlicher Spezies) geeignet sind, um die funktionelle Relevanz von Mutationen in einem Protein vorherzusagen. Die Sequenzvielfalt eines bestimmten Proteins ist das Ergebnis eines langen Evolutionsprozesses und liefert wertvolle Informationen über die Konservierung und die Variabilität eines Proteins. Eine systematische Überprüfung dieses Konzepts wurde bislang jedoch noch nicht durchgeführt. Dafür müsste ein vollständiges Set von allen möglichen Mutationen an möglichst vielen Positionen innerhalb eines Proteins erstellt, funktionell charakterisiert und anschließend mit einem umfassenden Orthologdatensatz verglichen werden. Für dieses Projekt wurde als Modellprotein der G-Protein-gekoppelte Rezeptor P2Y12 aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften und seiner physiologischen Relevanz bei der Thrombozytenaggregation ausgewählt. In einem definierten Rezeptorabschnitt wurde eine sättigende Mutagenese durchgeführt, bei der jeweils an jeder Position alle anderen 19 Aminosäurevarianten eingefügt wurden. Alle 1.254 generierten Rezeptormutanten wurden anschließend funktionell charakterisiert. Darüber hinaus wurden die funktionellen in vitro-Daten mit einem Datensatz von mehr als 70 Orthologsequenzen verglichen, um Übereinstimmungen zwischen der evolutionären Konservierung/Variabilität und der in vitro-Mutagenese zu finden. Es wurde gezeigt, dass die Funktion von 90,7 % der untersuchten Mutanten mit Hilfe von Orthologsequenzen korrekt vorhergesagt werden konnte. Demzufolge können Orthologsequenzen dazu verwendet werden, um nicht nur für GPCR sondern, vermutlich auch für viele andere konservierte Proteine die funktionelle Relevanz individueller Positionen und Mutationen zu prognostizieren. Orthologsequenzen können leicht aus öffentlich zugänglichen Datenbanken erhalten werden und Untersuchungen können somit schnell und kostensparend durchgeführt werden. Diese Methode wäre unter anderem auch für die Evaluierung krankheitsassoziierter Mutationen in Proteinen geeignet, für die es bislang keine etablierten funktionellen Tests gibt.

Using ortholog sequence data to predict the functional relevance of mutations in G-protein-coupled receptors.

Cöster M, Wittkopf D, Kreuchwig A, Kleinau G, Thor D, Krause G, Schöneberg T.
Institute of Biochemistry, Molecular Biochemistry, Johannisallee 30, 04103 Leipzig, Germany. 

FASEB J. 2012 Aug;26(8):3273-81. Epub 2012 May 18.

Abstract
Evaluating the functional relevance of naturally occurring gene variants usually requires experimental testing or is even impossible because of the lack of appropriate functional assays. Here we have analyzed whether comparative sequence data from orthologs are suitable to predict the functional relevance of mutations in a model protein, a G-protein-coupled receptor for ADP (P2Y12). The functional effect of every possible substitution at each amino acid position within a portion of P2Y12 (1254 mutants) was individually determined. Sequence analysis of >70 P2Y12 vertebrate orthologs revealed that this amino acid variability ensuring proper receptor function in vivo highly correlates (>90%) with the in vitro experimental data. Therefore, ortholog sequence data are helpful to predict the functional relevance of individual positions and mutations for P2Y12. It is likely that similar conclusions may be extended for other GPCRs and conserved proteins as well.

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